柳杉精油化学成分及其对对黑胸白蚁的毒杀活性研究

作者：

谢永坚

摘要：

我国每年因白蚁危害造成的经济损失超过30亿元。目前,国内外白蚁预防和防治仍然以化学杀虫剂为主,由于有机磷和有机氯杀白蚁剂的禁用,寻求新的防治白蚁技术和方法显得十分必要。利用精油或精油中的活性物质防治白蚁是目前白蚁防治领域的研究热点之一。柳杉作为我国本土的、分布广泛的丰富天然植物资源,值得深入研究它的生物活性。因此,本研究分析了柳杉精油化学成分及其杀白蚁活性,并对精油进行纯化、分离、鉴定,从生化水平、蛋白质水平以及基因水平探讨其杀虫机理；此外,本文初步探讨了α-松油醇类似物化学结构与杀白蚁活性的关系,取得如下主要结果： 1.柳杉精油化学成分及杀白蚁活性 为明确柳杉和日本柳杉精油对白蚁的毒杀活性及化学成分特征,采用GC-MS法,比较分析了柳杉和日本柳杉精油的化学成分,并测试2种精油对黑胸散白蚁的毒杀活性。结果表明,不同种柳杉精油的化学成分存在一定差异,柳杉精油杀白蚁活性高于日本柳杉。 本文进一步分析了昆明、雅安、武汉、恩施、合肥、南京、天目山、福州和庐山等9个国内主要分布区,不同季节、树龄,以及树皮、边材、心材和树叶4种器官的柳杉精油含量、化学成分及其杀白蚁活性。结果表明,不同产地、不同季节、树龄以及柳杉不同器官精油化学成分存在一定差异,但它们的杀虫活性差异不明显。同时,柳杉叶精油杀白蚁明显高于树皮、边材、心材。因此,柳杉叶精油可作为一种潜在的天然杀白蚁药剂。柳杉叶精油成分的鉴定与化学品系的分析,可以了解不同来源的柳杉叶精油组成分的差异与种源地之间的关系。本研究结果可以为柳杉品系的选育与精油的利用或生物活性测定提供参考依据。 2.柳杉精油有效杀虫成分的分离与鉴定 为进一步了解柳杉叶精油中具有杀白蚁活性成分。采用生物活性追踪法,利用硅胶柱层析,从柳杉叶精油中分离、纯化杀白蚁活性物质。通过红外光谱(IR)、质谱(MS)、紫外光谱(UV)、核磁共振(NMR)对柳杉叶精油分离得到的活性物质进行解析,经鉴定为α-松油醇,分子式为C10H18O,分子量为154.25,为单环单萜醇。α-松油醇对黑胸散白蚁具有较强的毒性,其毒力回归方程为Y=0.34+5.05x(R2=0.87),LC50为0.86mg/mL。本研究表明,α-松油醇可作为一种高效、环境友好的杀白蚁药剂。为进一步研究杀虫机理和化学结构--活性关系奠定基础,并为产业化开发提供理论依据。 3.α-松油醇对白蚁的杀虫机理 为探讨α-松油醇的杀白蚁作用机理。测定了α-松油醇对黑胸散白蚁体内解毒酶和抗氧化酶活性的影响。结果表明,α-松油醇对白蚁体内的解毒酶和抗氧化酶的活性均表现出较强的时间效应。LC50剂量(0.86mg/mL)的α-松油醇对黑胸散白蚁工蚁体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的酶活性随处理时间的延长整体表现出抑制作用；对谷胱甘肽转移酶(GST)、超氧化物岐化酶(SOD)表现诱导增加作用。用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μl/mL剂量的α-松油醇处理试虫后,各剂量的α-松油醇均可抑制黑胸散白蚁体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)和钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)的酶活性。白蚁体内的谷胱甘肽转移酶(GST)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的酶活性随α-松油醇处理剂量的增加而诱导增加。其中,α-松油醇对Na+-K+-ATPase具有较强的抑制作用,且随着中毒症状的加剧,对该酶的抑制作用增强。因此,Na+-K+-ATPase可能是α-松油醇的主要作用靶标。 为了进一步探讨α-松油醇的作用机理。本文利用差异蛋白质组学技术,研究α-松油醇胁迫下黑胸散白蚁体内蛋白质的变化,观察到40个蛋白质发生了差异表达,其中7个蛋白点为上调表达,24个点为下调表达,9个蛋白点为在处理后新增或消失。质谱分析共鉴定出40个蛋白点,包括能量代谢、转运蛋白、细胞骨架蛋白等。这些蛋白参与了白蚁体内的生理生化过程,表明白蚁在应对α-松油醇的响应是一个网络系统。 在α-松油醇胁迫下黑胸散白蚁体内相关的蛋白质发生表达量的变化,为更好的了解基因水平的表达差异,本研究应用RT-PCR和RACE技术,克隆得到黑胸散白蚁与能量代谢相关的ATP合成酶(ATP synthase-β-subunit)基因的大部分序列,从序列的保守性可推知ATP合成酶在不同物种中的功能比较保守。 4.α-松油醇类似物杀白蚁活性研究 为研究α-松油醇类似物结构与杀白蚁活性的关系,测定了单萜类、醇类、酚类、酮类、醛类、酯类和醚类等7个系列42个化合物对白蚁的熏杀效果,结果表明,含氧萜类化合物的杀白蚁活性高于萜类化合物；羟基(-OH)基团的位置强于乙酰基：酚类物质结构上羟基(-OH)位置不同,生物活性也不一样：丙烯基双键的位置对杀白蚁活性很重要：大多数酮类化合对白蚁的熏杀效果都比醇类化合物强,羰基的存在可能提高了化合物的毒效。本研究初步揭示了单萜类化合物的不同化学基团对杀白蚁活性的影响,并发现了大量活性明显高于α-松油醇的化合物。 通过本论文研究,明确了不同种间、不同产地、不同季节、不同树龄及不同器官柳杉精油化学成分存在一定程度的差异,同时,这些精油对白蚁都具有较好毒杀效果,但活性差异不明显。首次从柳杉叶精油中分离得到杀白蚁活性物质a-松油醇,并对它的杀虫机理进行研究,发现α-松油醇可抑制黑胸散白蚁体内的解毒酶和诱导氧化酶系。同时,本文开展了黑胸散白蚁响应α-松油醇胁迫的蛋白质组学研究,找到了多个与α-松油醇胁迫相关的蛋白,揭示了白蚁对α-松油醇响应是一个网络反应。初步揭示了单萜类化合物的不同化学基团对杀白蚁活性的影响。本研究结果为柳杉精油的应用及杀白蚁新药的研制提供科学依据。

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关键词：

柳杉 精油 化学成分 α-松油醇 黑胸散白蚁 杀白蚁活性 杀虫机理 萜类化合物